基于濾膜上細菌直接計數法的細菌總數快速檢測
【摘要】 細菌總數快速檢測在質量監測中具有重要的意義，目前除了經典的平板培養法以外，還有微菌落法、阻抗法等快速檢測方法，這些方法或者需要較長的檢測時間，或者需要較高的檢測成本。本研究提出一種不需要培養而在濾膜上直接計數的細菌總數的快速檢測方法，它主要分為過濾、染色、顯微鏡計數和計算四個步驟。計算細菌總數時，根據細菌在濾膜上的分布特點，對傳統公式進行改進，提出按區域計算細菌總數的計算方法，提高了檢測精度。研究結果表明，該方法與傳統的平板培養法無顯著性差異（t=0.847，P=0.436＞0.05），是一種低成本、快速的細菌總數檢測方法。
1 引 言
細菌總數計數的研究已有很多，目前國標規定的方法為平板計數法，該方法是將樣品加入瓊脂營養基，在37 ℃下培養24～48 h后計數。這種方法精度高，但耗時長，難以滿足實際工作需要。為了簡化檢測程序、縮短檢測時間，國內外學者進行了大量的快速檢測方法的研究，提出了阻抗檢測法〔1〕、Simplate TM全平器計數法〔2〕、微菌落技術〔3-5〕、紙片法〔6-7〕等檢測方法，取得了的成果，但檢測時間仍在4 h以上。
本研究在分析了已有研究成果的基礎上，提出了在濾膜上染色后，直接計數的細菌總數檢測方法，具體步驟為：用集菌儀進行細菌收集→在膜上進行染色→在油鏡下計數→按公式計算出菌液濃度。實驗結果表明，該方法與傳統的平板培養法無顯著性差異，檢測時間約1 h，是一種快速的細菌總數檢測方法。
2 材料與方法
2.1 材料
本研究中用的試驗材料有集菌儀（杭州泰林生物技術設備有限公司），染色劑，生物顯微鏡（寧波永新光學股份有限公司），聚碳酸脂膜（直徑47 mm）。
2.2 實驗方法
2.2.1 準備工作 卸下集菌儀的濾網（見圖1），統計濾網上小孔總數，為計算菌液濃度做準備。另外，還需對集菌儀中的集菌器進行高壓滅菌，以防止過濾過程中引入外源細菌。
2.2.2 細菌收集 取濃度的霉菌菌液300～500 ml，裝在集菌儀上，集菌儀采用蠕動加壓方式對菌液施加的壓力，使菌液流過孔徑為0.45 um的聚碳酸脂膜。采用過濾方法是因為它可以使細菌相對均勻地分布在濾膜上，而選用聚碳酸脂膜是因為這種膜具有良好的透光性，便于用顯微鏡觀察。
2.2.3 染色 集菌后取下濾膜，切下一部分放在載玻片上，進行染色、固定。染色的目的是增大細菌與背景的對比度，便于觀察。
2.2.4 顯微鏡計數與計算 菌液經集菌儀過濾后，細菌在濾膜上的分布見圖2、圖3，由圖可以看出細菌分布具有以下兩個特點：一是細菌集中在一個個的圓形區域內，這些圓形區域和擋板的小孔相對應；二是各個圓形區域之間細菌很少。根據膜上細菌分布的這種特點，提出以圓形區域為單位進行計數，統計出圓形區域內細菌的平均個數，從而計算出菌液中細菌總數。具體步驟如下：隨機選擇10個圓形區域，在油鏡下，調節焦距以獲得較清晰的圖像（見圖4），統計每個圓形區域內的細菌個數，然后按公式(1)計算出菌液的濃度。
X=A10×N/V(1)圖2 膜上細菌的區域分布
Fig 2 The distributing region of bacteria on the filter(100倍)
圖3 膜上細菌的區域間隔
Fig 3 The space among the distributing regions(100倍)
圖4 膜上細菌染色后圖像
Fig 4 Figure of bacteria after coloration(1 000倍)
式中：X表示待檢菌液濃度（CFU/ml）
A表示10個圓形區域內細菌總數
N表示濾網上小孔總數
V表示集菌時所用待檢菌液體積（ml）
3 結果與討論
3.1 實驗結果
按上述方法計算得到的結果與平板培養法得到的結果見表1。表1 兩種方法得到的細菌總數
Table 1 Total bacteria number by two different methods
樣本1樣本2樣本3樣本4樣本5樣本6染色鏡檢
(cfu/ml）185168157165171166平板培養
(cfu/ml)176155165158183152
對表1中兩組數據進行配對t檢驗，在α=0.05時，雙尾檢驗結果如下：t=0.847，P=0.436＞0.05，說明兩種方法得到的結果無顯著性差異。
3.2 討論
3.2.1 計算公式的改進 用集菌儀對樣本菌液進行過濾時，由于濾網擋板的作用，使得細菌不是均勻地分布在整個濾膜上，而是集中分布在濾網的小孔處，所以，計算細菌總數時，不能采用公式X=A40×Φ1Φ22/V（其中Φ1，Φ2分別為濾膜直徑和視野直徑），該公式是微菌落方法檢測細菌總數中的常用計算公式。在本實驗中，根據細菌分布的特點，提出以圓形區域為單位計算細菌總數的思路，使計算結果更接近真實值，從而提高了檢測精度。
3.2.2 細菌大小的影響 細菌大小對本實驗的影響主要體現在鏡檢時，如果細菌太小，顯微鏡計數時不能將細菌從背景中分辨出來，我們的實驗結果顯示，不能分辨大腸桿菌和葡萄球菌，而較大的霉菌可以清晰地分辨。
3.2.3 檢測時間進一步縮短 細菌總數的經典檢測方法是平板培養法，得到的結果精度高，但是它所用時間長，為了縮短檢測時間，出現了微菌落法，將檢測時間縮短為4 h左右〔3-5〕。本研究不對細菌進行培養，而是在膜上染色后直接用顯微鏡計數，大限度地縮短了檢測時間，使整個檢測時間在1 h左右。
4 結論
本研究用集菌儀將菌液過濾后，取濾膜一部分進行染色、制片，然后在油鏡下統計細菌個數。根據細菌在濾膜上的分布特點，提出將圓形區域作為統計單位，得到圓形區域內細菌的平均個數，從而計算出菌液濃度。實驗結果表明，按照該方法得到的結果與平板培養法的結果無顯著性差異。與平板培養法和微菌落法相比，該方法不需要細菌培養，檢測時間只需要1 h左右，明顯縮短了檢測時間，是一種快速、有效的細菌總數檢測方法。